Esta tecnología permite analizar de forma simultánea diversas características celulares, lo que proporciona información de un gran número de parámetros de cada una de las células que se analizan, identificando en una muestra subpoblaciones de células diferentes, incluso cuando están escasamente representadas.

La citometría de flujo es una poderosa herramienta para la valoración del estado inmunológico, y representa un método rápido, altamente sensible, automatizado y cuantitativo de análisis de las poblaciones linfocitarias.

Estudio de Subpoblaciones Linfocitarias

El sistema inmune de cada individuo se comporta según el número y estado funcional de los diferentes subtipos de linfocitos circulantes: linfocitos T, linfocitos B y células Natural Killers.  Su estudio tiene un importante valor en el diagnóstico y seguimiento de inmunodeficiencias primarias y secundarias, enfermedades autoinmunes, infecciones, atopías,  neoplasias y en el trasplante de médula ósea y de otros órganos  así como durante las terapias inmunosupresoras o inmunoduladoras en determinadas situaciones clínicas.

Descripción de tipos de linfocitos

Los linfocitos constituyen una parte del sistema inmune que es denominada Inmunidad Adaptativa o Adquirida debido a su capacidad de reconocer específicamente antígenos extraños y generar memoria inmune.

Los linfocitos en la sangre periférica (circulación) son heterogéneos y pueden clasificarse ampliamente en células T (derivados del Timo), células B (derivados de la médula ósea) y células asesinas naturales (NK). Todos estos tipos celulares son indistinguibles morfológicamente por microscopia óptica pero pueden ser identificados por sus diferentes características antigénicas en sus membranas celulares. Los linfocitos T, B y NK juegan un rol central en la función del sistema inmune. Los diferentes subpoblaciones de linfocitos pueden realizar reconocimiento antígeno específico, ejecutar funciones efectoras y/o controlar el tipo e intensidad de las respuestas inmunes humorales y celulares.

Cada uno de estos subconjuntos de linfocitos puede ser identificado por una combinación de uno o más marcadores de superficie celular. El antígeno CD3 es un marcador de Linfocitos T (Pan-T), así las células T CD45+CD3+ son los actores principales en la Inmunidad Celular y pueden dividirse en 2 categorías amplias, según su función biológica y su expresión de antígenos de superficie CD4 o CD8:

• Linfocitos T cooperadores (del inglés “Helper”) que se definen fenotípicamente como CD3+CD4+. Actúan balanceando la inmunidad humoral, la inmunidad celular y las respuestas inmunes innatas mediante la secreción de citoquinas.   
• Linfocitos T citotóxicos se caracterizan por ser CD3+CD8+ y su rol es la destrucción de células infectadas con virus  y células tumorales a través del reconocimiento mediante las moléculas del CMH (Complejo Mayor de Histocompatibilidad).
• Los Linfocitos B (CD45+CD19+) son los responsables de la Inmunidad Humoral. Luego de ser activados por antígenos o macrófagos vía Li T, se diferencian a células plasmáticas las cuales producen y secretan inmunoglobulinas específicas (anticuerpos) y se caracterizan por expresar los marcadores CD19 y CD20 en superficie (pan-B).

El fenotipo CD45+CD3-CD56+CD16+ identifica a las células Natural Killer (NK) que son una población de linfocitos con funciones efectoras citotóxicas (caracterizada por ocurrir en ausencia de antígenos presentados en el contexto de moléculas del CMH) que tienen un rol preponderante en la regulación de la hematopoyesis, la defensa contra las infecciones virales y la destrucción de células tumorales malignas.

Metodología de Doble plataforma

El estudio de las poblaciones linfocitarias mediante citometria de flujo está basado en el uso de anticuerpos monoclonales que son capaces de unirse a los determinantes antigénicos expresados por los linfocitos. Una vez realizada la tinción especifica de los leucocitos mediante la incubación de la sangre periférica con una mezcla de anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos, los glóbulos rojos son removidos por lisis y los leucocitos, los cuales son inafectados por este proceso, son adquiridos y analizados en el citometro de flujo.
En general, los recuentos absolutos se calculan a partir del número absoluto de linfocitos (obtenido a partir del contador hematológico) y el valor por­centual para el subconjunto de células, por un método denominado doble plataforma.  Así, mediante citometria de flujo, la intensidad de fluorescencia correspondiente a cada anticuerpo específico puede ser obtenida y el porcentaje de las subpoblaciones puede ser estimado.

Utilidad clínica

La evaluación de las subpoblaciones linfocitarias para la valoración del sistema inmunitario está indicado en numerosos procesos diagnósticos y seguimiento de enfermedades, entre los que destacan:

• Monitoreo del recuento de Li T CD4 en pacientes VIH positivos. En los pacientes que están infectados con el VIH, el recuento de CD4  es el principal indicador de la función inmune. Además permite valorar  el riesgo de progresión clínica de la infección, la clasificación de estadios clínicos basada en el CDC, sirve como guía para iniciar profilaxis para infecciones oportunistas y detectar de falla de tratamiento inmunológica. La Secretaria de Salud de la Nación ha recomendado que todos los pacientes VIH-positivos evalúen cada 3 a 6 meses para el nivel de linfocitos T CD4.
• Evaluación del diagnóstico y seguimiento de inmunodeficiencias primarias, incluyendo inmunodeficiencia combinada severa (SCID). En algunas situaciones, el status T/B/NK (CD3/CD19/CD56) es suficiente para anticipar una IDP específica  y provee evidencia diagnóstica de ID celular, humoral o combinada, que posteriormente se confirma mediante otros estudios. En contraste, en pacientes con reducido número absoluto de Li T o importante aumento de células NK, la causa primaria es generalmente un poco más difícil de ser dilucidada. Sin embargo, en  muchas IDP, el número absoluto de células T, B y/o NK observadas son normales.
• Monitoreo inmune después de la terapia inmunosupresora para trasplante, enfermedades autoinmunes y otras condiciones inmunológicas donde se utiliza dicho tratamiento.
• Evaluación de la reconstitución inmune post trasplante de células hematopoyéticas.
  
• Detección precoz de anomalías cuantitativas en las poblaciones linfocitarias en infecciones (HIV, CMV, EBV, etc.), procesos inflamatorios, alergias y enfermedades autoinmunes. Se han descrito anormalidades en el número y el porcentaje de linfocitos T, B y NK  en una serie de estados de enfermedad diferentes. También es útil como un ensayo preliminar en condiciones patológicas no identificadas en pacientes con leucopenia.
• Evaluación de poblaciones linfocitarias en muestras endocervicales de pacientes con candidiasis vaginal recurrente.

Variables pre analíticas y analíticas

Los recuentos de poblaciones linfocitarias deben ser interpretados apropiadamente en el contexto de la presentación clínica y otros parámetros inmunológicos y los resultados de las pruebas de laboratorio pertinentes.

Variables pre analíticas:

• Aumentado: Ejercicios intensos. Tabaquismo.
• Disminuido: Alcoholismo, malnutrición. Ejercicios intensos.
• Ritmo circadiano: Para la monitorización en serie de poblaciones linfocitarias se recomienda evaluar al paciente a la misma hora del día para tener en cuenta la variación diurna (circadiana), dado que se ha demostrado un aumento progresivo en el recuento de Li T CD4 a lo largo del día, mientras que los Li T CD8 y CD19 + aumentan entre 8:30 am y mediodía sin cambio entre mediodía y tarde. Por otro lado, los recuentos de células NK son constantes a lo largo del día. Estas variaciones circadianas en los recuentos de células T circulantes se correlacionadan negativamente con la concentración plasmática de cortisol.
• Otros factores no inmunes como la edad, el género, los niveles de corticoides, influencian la proporción de los distintos subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica.

Variables por enfermedad:

Aumentado:

• Linfocitos T: fiebre tifoidea, tuberculosis pulmonar, brucelosis, septicemia, rubeola, hepatitis viral, sarampión, mononucleosis infecciosa, enfermedad, sífilis, linfogranuloma venéreo, toxoplasmosis, neoplasmas, leucemia linfocítica crónica, talasemia mayor, agranulocitosis, otitis media, púrpura trombocitopénica idiopática, Mycoplasma pneumoniae.
• Linfocitos T CD4: artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, sarcoidosis.
• Linfocitos TCD8: SIDA, infección por citomegalovirus.

Disminuído:

• Linfocitos T: gastroenteritis, tuberculosis, septicemia, fiebre amarilla, toxoplasmosis, sarcoidosis, neoplasmas, diabetes, malnutrición, agammaglobulinemia, síndrome de Di George, SIDA, anemia aplásica, ataxia-telangiectasia, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, influenza, apendicitis, enfermedad renal crónica, lupus eritomatoso sistémico, efectos de rayos X.
• Linfocitos T CD4: síndrome de Di George, SIDA, infección por citomegalovirus.
• Linfocitos T CD8: síndrome de Di George, artritis reumatoidea.
• Linfocitos B: agammaglobulinemia, inmunodeficiencia común variable, hepatitis viral.

Variables por drogas:

Aumentado:

• Linfocitos T: ácido aminosalicílico, levodopa, narcóticos, tiocolchicina.

• Linfocitos T: clorambucil, corticotropina, ibuporfeno, prednisona, radioterapia. Ácido fólico, glutamato, hidrazinas, tiamina y vitamina E en grandes dosis.
• Linfocitos TCD8: etanol (en cirróticos y pancreatitis).
• Linfocitos B: prednisona.

Autora: Dra. Romina Ranocchia

Área Inmunología - Autoinmunidad Fares Taie Instituto de Análisis

Contacto: citometria@farestaie.com.ar  

Determinaciones disponibles en Fares Taie Instituto de Análisis

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